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兩步發酵法的第一步，先用根霉將糖類發酵生成富馬酸，即富馬酸發酵，這里的糖較多的使用葡萄糖，葡萄糖可由淀粉經雙酶水解而得。

第二步是在前面所產的富馬酸中接入酵母菌或細菌進行發酵，將富馬酸轉化為L-蘋果酸，即轉化發酵。采用這種方法，蘋果酸對糖轉化率最高可達60%以上，但是畢竟發酵周期太長，前后加起來要8～9天。雖然兩步法與一步法一樣，國內外學者正在不斷地探索，取得了一些有價值的進展，但至今仍然未見工業化生產的報道。 無論是一步法還是兩步法發酵，如以淀粉為原料，在使用前都需進行水解處理，使之成為葡萄糖，而淀粉的水解方法是雙酶水解法。

3.將反丁烯二酸或順丁烯二酸經高溫高壓催化加水，可制得DL-蘋果酸。4.萃取法將未成熟的蘋果、葡萄、桃等的果汁煮沸，加入石灰水，生成鈣鹽沉淀，然后再經處理生成游離蘋果酸。此法目前已不采用。5.發酵法從反丁烯二酸利用生物酶發酵生產左旋蘋果酸。6.DL-蘋果酸的合成以順丁烯二酸或反丁烯二酸在高溫、加壓下水合制取。用陰、陽離子交換樹脂提純。7.L-蘋果酸的合成利用短桿菌氨基因細胞由反丁烯二酸制取。8.：FC，22，38，50，54；BU，39。9.制法：于高壓反應釜中加入順丁烯二酸（2）1.16kg（10mol），水2.1L，攪拌下升溫至180～190℃，保持壓力1Mpa，反應10h。冷卻至100℃以下，放出殘壓。將反應液倒入蒸餾瓶中，減壓濃縮，直至有結晶析出。冷卻，抽濾，干燥，得蘋果酸（1）1.2kg，mp128～130℃。收率90%。